domingo, 29 de mayo de 2011

Elementos esenciales de un vector de expresión

Expresar el producto de algún gen en cualquier célula supone conocer en profundidad los mecanismos de expresión génica en la célula, es decir, conocer los mecanismos moleculares de replicación, transcripción y traducción (dogma central de la biología molecular) en el sistema celular con el que estamos trabajando y también los principios básicos de ingeniería genética.

Cuando queremos insertar o transfectar un gen nuevo en un determinado sistema celular con interés comercial, experimental o por curiosidad (el combustible de la ciencia), debemos hacerlo mediante la construcción correcta de un vector de expresión.

Un vector de expresión se puede definir como una construcción genética que  permite la introducción de un gen exógeno determinado en una célula diana que sea capaz de expresarlo
eficientemente. Sus elementos varían enormemente en función de las pretensiones que tengamos, pero básicamente contiene los siguientes elementos génicos, aunque podemos modificarlo mediante ingeniería genética:

            -Un origen replicación autónomo
            -Un promotor del gen de interés
            -Una región de clonaje múltiple donde vamos a insertar gen de interés        
            -Gen de selección
            -Secuencias génicas reguladoras

 
Para comenzar a construir el vector de expresión debemos conocer en profundidad qué proyección tenemos con nuestro transgen. Podemos querer transfectar un vector en células de manera momentánea (el vector se pierde en los sucesivos ciclos de división celular) para lo cual podemos no insertar un origen de replicación autónomo o podemos querer transfectarlo de manera estable para que se mantenga tras los ciclos de división celular. Puede ser episomal (el vector de expresión no se inserta en el DNA cromosómico) o insercional (el vector se inserta en el DNA cromosómico). Debemos por tanto tener en cuenta el origen de replicación autónomo, si lo insertamos en la construcción o no, debe en general, ser reconocido por la maquinaria replicativa del sistema celular al que vamos a transfectar de forma que nos permita realizar copias con los ciclos de división celular que realiza la célula tranfectada. Debemos buscar un promotor que nos interese, para ello lo hacemos buscando en lo que la naturaleza nos ofrece, en virus y bacterias generalmente. Debemos considerar diferentes promotores:

 -Constitutivos: son reconocidos por la RNA polimerasa del sistema celular con el que estamos trabajando, generalmente son muy potentes (alta eficiencia de transcripción, número elevado de eventos de transcripción).

-Histo-específicos (específico de tejido): operan selectivamente en tipos particulares de células.

-Inducibles: permiten controlar el “encendido” o “apagado” de la expresión mediante el tratamiento o no con algún método químico o físico.

-Mínimos: en general permiten una transcripción basal mínima del gen de interés se utilizan generalmente para estudiar otros elementos de regulación de la transcripción como los enhancers.

El sitio de clonaje múltiple del vector o polilinker que es una región del DNA del vector de expresión provista de varias dianas únicas para diferentes enzimas de restricción, de modo que en cada experimento se pueda elegir la que más convenga para la inserción del gen de interés.

El gen de selección es un segmento de DNA que codifica para la expresión de una proteína cuya función o actividad permita identificar aquellas células donde nuestro vector se ha transfectado como pretendíamos. Así existen proteínas como GFP o green fluorescent protein que emite fluorescencia en la zona verde del espectro visible, de forma que cuando realizamos un ensayo de transfección aquellas células que emiten esta fluorescencia han incorporado el transgen de interés.

Otras secuencias de regulación. Son múltiples y depende del sistema celular que estemos transfectando. En general están encaminados a mejorar la eficiencia de transcripción, traducción o maduración del mRNA.

Gracias a estos vectores podemos obtener transgénicos de forma que superamos el límite biológico entre especies, ¡ya no existen las especies! Podemos ser capaces de introducir genes de interés en células que en condiciones naturales no lo tendrían, y así, generar productos nuevos con mayor facilidad, para purificarlos y comercializarlos, optimizar los procesos de producción industrial o generar microorganismos con nuevas características de interés que aporten beneficios.

8 comentarios:

  1. Eso de que ya no existen las especies me parece muy atrevido de tu parte, un individuo u organismo transgénico dista mucho de pertenecer a una nueva especie. O qué cuando te enfermas de algún virus que se inserta en tu genoma dejas de ser humano???...entonces???

    ResponderEliminar
  2. Entiéndase como que ya no hay "barreras artificiales entre especies" definidas por sus homologías del genoma, en el sentido que podemos variar el material genético y hereditario de un organismo, dotándole de nuevos genes, y de nuevas capacidades diferentes a las que lo definían como organismo... Pueden generar un antibiótico, o un producto que antes eran incapaces, en el momento que varías su genoma, ya no puedes clarificarlo tan fácilmente como una especie... En cierto modo, cuando ciertos virus como los Herpesvirus insertan establemente su genoma en determinados tipos celulares humanos, están generando células que no son idénticas genéticamente a la mayoría de células que definen al organismo como especie... luego... sí se puede sospechar que esos tipos celulares no pertenecen a la misma especie... Son formas naturales de intercambio de genoma y una parte esencial de la evolución bacteriana.

    Gracias por comentar!

    ResponderEliminar
  3. Este comentario ha sido eliminado por el autor.

    ResponderEliminar
  4. Soy una estudiante de biotecnología y estoy estudiando el tema de la transfección retroviral, y me preguntaba si sabría cómo es un vector no autónomo, o sea en qué se diferencia del autónomo? Gracias.

    ResponderEliminar
  5. Buenas. Un VECTOR AUTÓNOMO se entiende como aquel vector de expresión genética, por ejemplo un plásmido, que tiene en su secuencia un origen de replicación autónomo, es decir, una secuencia de nucleótidos donde la maquinaria de replicación de la célula se puede "adherir" y replicar (hacer una copia idéntica) del vector multiplicando las copias del vector. Este tipo de vector se suele utilizar cuando transfectamos una célula y queremos que las generaciones futuras de la célula, según se va dividiendo, dispongan de la copia del vector. Si queremos que el vector sea autónomo, debemos saber que este origen de replicación debe ser compatible con el sistema celular elegido, es decir, que la maquinaria enzimática que posibilita la replicación celular de su propio genoma sea capaz de actuar también en el vector. Un VECTOR NO AUTÓNOMO, por contra, no tiene estas secuencias y por tanto, el vector transfectado en la célula, se pierde con las generaciones futuras. Imaginemos que una célula es transfectada con un sólo vector NO autónomo; al dividirse la célula, el vector se irá a una de las dos células hijas, al azar. De esta forma habrá dos células hijas, una con vector y otra sin vector, en lo sucesivos ciclos irá pasando lo mismo... Espero que haya sido de utilidad. Un saludo, Víctor.

    ResponderEliminar
  6. Ejemplos de aplicación de un vector no autónomo?

    ResponderEliminar
  7. Por ejemplo para transfecciones transitorias, si queremos inhibir la expresión de una proteína con secuencias de siRNA, la clave es que son rápidos, sencillos y probablemente más eficiente.

    ResponderEliminar
  8. Los tipos de promotores , inducibles y constitutivos como intervienen en las secreciones proteoliticas?

    ResponderEliminar