Electroforesis

La electroforesis es una técnica instrumental de gran interés para el campo bioquímico. Se trata de una técnica analítica y preparativa. El principio de la electroforesis se basa en el diferente comportamiento que presentan las moléculas cargadas frente a un campo eléctrico general. Es utilizada rutinariamente en los laboratorios clínicos y de investigación básica y aplicada. Es muy útil para separación e identificación de proteínas o ácidos nucleicos.

Cuando existe una muestra en un solvente con ciertas moléculas cargadas y le aplicamos un campo eléctrico (E) las moléculas cargadas negativamente (aniones) experimentan una fuerza de atracción Fe igual a la intensidad del campo eléctrico (E) por la carga (q) del anión. El movimiento de esta partícula aniónica que consideramos ideal (esférica y lisa) experimenta una fuerza de sentido contrario que se opone a su desplazamiento, es la fuerza de fricción (Ff). Ésta por la ley de Stokes es igual al coeficiente de fricción f multiplicado por la velocidad de la partícula aniónica V. El coeficiente de fricción f es igual a 6xπxηxR donde η es la viscosidad y R es el radio de la partícula ideal.

De forma, por tanto, que la velocidad de desplazamiento (V) de la partícula será constante cuando se igualen las fuerzas, es decir, la resultante de las fuerzas sea 0 y en ese momento la velocidad podemos calcularla como:

Consideramos el parámetro µ como la movilidad electroforética que es una magnitud característica de la molécula y lo definimos como la velocidad de la molécula cargada por unidad de campo eléctrico, es decir:

Existen ciertos parámetros que afectan la electroforesis como la temperatura o los parámetros del campo eléctrico tales como el voltaje, la intensidad o la resistencia.

Disponemos de dos tipos de electroforesis generales que son la electroforesis libre y la electroforesis en soporte o zonal. La electroforesis libre es aquella que inició Tiselius en 1948 y que básicamente consiste en el desplazamiento que sufre una molécula cargada en un medio líquido. 

Este tipo de electroforesis libre ya no se utiliza en la actualidad. El otro tipo de electroforesis es la zonal o en soporte, este tipo supone la aplicación de la muestra desde un origen conocido y se deja correr la electroforesis en un soporte sólido formado de almidón (ya no se utiliza), papel, sílice o geles, los más utilizados. Los geles forman un tamizado poroso formado por entramados moleculares en forma de redes de los cuales se puede elegir el tamaño de poro dependiendo de las concentraciones químicas de sus componentes. Para separar proteínas se suele utilizar geles de poliacrilamida mientras que para separar ácidos nucleicos se suele utilizar geles de agarosa. 

Las ventajas de la electroforesis en soporte en gel respecto a la electroforesis libre son muy amplias, así podemos aplicar la muestra desde un origen conocido, el frente de llegada de las moléculas es menor en la electroforesis en soporte porque en la libre existe un gran movimiento aleatorio browniano (ya que las moléculas en solución tienen energía cinética propia), y por último, señalar que en la electroforesis libre el movimiento de las moléculas se debe a su densidad de carga (q/m) mientras que en la electroforesis en soporte en gel, la movilidad electroforética es por densidad de carga y por tamaño, ya que el gel forma un tamizado, así permite un mayor poder de resolución. Por ejemplo si hay dos moléculas A y B con diferente tamaño (A>B) pero igual densidad de carga, en la electroforesis libre ambas migrarán lo mismo mientras que en la electroforesis en soporte en gel; B migrará más, ya que difunde más fácilmente entre el entramado poroso del gel. 

El proceso de electroforesis en soporte en gel es el más utilizado, y existen variedades al proceso electroforético que puede ser electroforesis continua o discontinua. Lo que cambian son las condiciones y el tipo del gel que se utiliza en una. También debemos saber que las proteínas pueden tener carga positiva o negativa, no como los ácidos nucleicos que tienen carga negativa. Nosotros vamos a describir un proceso general electroforético para separar proteínas. Así vamos a necesitar:

1-Fuente de corriente continua.

2-Cubetas de electroforesis donde se añade el tampón de electroforesis, este tampón suele tener un pH de entorno a 9, que provoca que las proteínas tengan carga negativa.

3-Placas/tubos donde se dispone del soporte en gel.

4-Muestra a separar que se carga con glicerol/sacarosa (agentes que aumentan la densidad y mantienen a la muestra hundida en su pocillo adecuado) y azul de bromofenol (es un compuesto coloreado de carga negativa y pequeño que nos marca el frente de avance de la electroforesis, para saber básicamente cuando hay que parar el proceso).

Como hemos indicado la electroforesis en soporte en gel puede ser continua o discontinua. Denominamos electroforesis continua a aquella en las que las condiciones o el tipo de gel no cambia, mientras que en la electroforesis discontinua hay una variación de las condiciones electroforéticas y del tipo del gel. Así Ornstein-Davis definieron el proceso de electroforesis discontinua en la que el gel cambiaba. De forma que el tampón de electroforesis de las cubetas era de Tris-Glicina de pH 8,3, y luego los geles los dividían en dos regiones, primero una región denominada gel de empaquetamiento con un tampón de Tris-HCl de  pH de 6,3-6,7 y un tamaño de poro de poliacrilamida grande y posteriormente una región de gel denominada separador con un tampón de Tris-HCl de pH de 8,8-8,9 y un tamaño de poro menor. Lo que pretendía con esta división del gel, era minimizar el efecto de diferencias de salida de las moléculas que se iban a separar, de forma que el gel empaquetador ralentiza el movimiento de salida de las moléculas y las sitúa o concentra al mismo nivel antes de migrar resolutivamente y posteriormente el gel de separación o de resolución al cambiar las propiedades del pH y el tamaño del poro resuelve finalmente la migración de las proteínas.

También debemos considerar el uso de agentes desnaturalizantes y reductores en el proceso de electroforesis. El agente desnaturalizante más utilizado en electroforesis en proteínas es el SDS o dodecil sulfato sódico que es un detergente derivado del ácido graso láurico (12 C)  y que es capaz de desnaturalizar las proteínas y dotarlas de carga negativa, además se une a las proteínas en proporciones constantes (1,4 g de SDS/g de proteína) de forma que al aplicarlo en la electroforesis en geles de poliacrilamida son capaces de provocar que todas las proteínas tengan la relación carga/masa (q/m) constante y que por tanto se separen por tamaño molecular, este tipo de electroforesis son muy utilizadas y se denominan SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes SDS). También podemos aplicar el uso de condiciones reductoras gracias al β-ME (beta-mercaptoetanol) o el DTT, estos productos son capaces de reducir los puentes disulfuro entre las subunidades de una proteína con estructura cuaternaria de forma que podemos determinar el número de monómeros que la componen.

Finalmente debemos señalar que en la electroforesis en geles con SDS, Klaus Weber y Mary Osborn (tras las descripciones y estudios de entre otros el español Eladio Viñuela), demostraron que los pesos moleculares de la mayoría de las proteínas pueden ser determinados midiendo la movilidad relativa en SDS-PAGE, de hecho, había relación lineal entre la movilidad electroforética relativa de una proteína y su peso molecular, de esta forma, conociendo los pesos moleculares de ciertos patrones proteicos podemos determinar el peso molecular de una proteína desconocida.