Proteínas fluorescentes

Las proteínas fluorescentes (FPs) son macromoléculas proteicas capaces de emitir bioluminiscencia cuando son excitadas a una determinada longitud de onda.

Desde hace más de una década, la proteína verde fluorescente (GFP) ha sido usada como un marcador que puede ser unido genéticamente a una gran variedad de proteínas (proteínas de fusión) para estudiar su distribución y su dinámica, o alternativamente, para la visualización de compartimentos celulares o células entera de un organismo.

Sus aplicaciones han revolucionado la biología molecular hasta el punto que numerosos estudios se centran en la búsqueda y el aislamiento de FPs naturales, así como en el incremento de mejoras sustanciales de las FPs ya descubiertas, con el objetico de aumentar el espectro de colores. Algunas de estas mejoras persiguen incrementar las propiedades de brillo, longitud de onda de emisión, tiempo de maduración y estado monomérico.

Junto a las ya clásicas proteínas verde fluorescente y sus variantes, los avances más recientes han permitido el desarrollo de proteínas monoméricas rojas fluorescentes que han mostrado mejoras sustanciales.

En la siguiente revisión queremos mostrar los mecanismos bioquímicos generales de las proteínas fluorescentes, así como las mejoras que se han ido realizando progresivamente. Finalmente queremos remarcar algunas aplicaciones y ejemplos actuales en el uso de proteínas fluorescentes en el campo de la biología molecular.

En los años 1960,  mucho antes que la primera GFP fuera usada como testigo, se descubro que cierta clase de antozoos y de hidrozoos (filo Cnidarios) eran capaces de emitir luminiscencia cuando recibían estímulos mecánicos. El descubrimiento de estos fenómenos supuso un elevado interés por el mecanismo intrínseco de la bioluminiscencia. De forma que numerosos científicos se lanzaron a la descripción del mecanismo de estos procesos. Los dos sistemas bioluminiscentes más estudiados son el de Renilla reniformis y el de Aequorea victoria.

El sistema bioluminiscente de Renilla está compuesto de un pigmento, luciferina, sustrato de la luciferasa, y la GFP. Ocurre que cuando existen señales de estrés (frecuentemente unidas a aumento de la concentración de Ca²⁺ intracelular), la luciferasa cataliza la descarboxilación oxidativa de la luciferina, que se transforma en oxi-luciferina. La oxi-luciferina formada es capaz de emitir luz azul, la cual, es transferida a la GFP vía transmisión de energía de fluorescencia, y es remitida a 509 nm (espectro verde). El sistema bioluminiscente de A. Victoria es muy parecido, y está compuesto por aequorina y la GFP trabajando juntas. Por tanto, ambos sistemas disponen de la GFP, de forma que los científicos trabajaron en el aislamiento de esta proteína (esquema 1).

La GFP fue aislada por primera vez por Osamu Shimomura en A. Victoria. Y fue clonada en 1992. Pronto su potencialidad para ser molécula testigo fue obvia.

La GFP es una proteína de 27-KDa Está constituida por 238 aminoácidos, que forman once cadenas beta, cuyo conjunto forma un barril muy estable con el fluoróforo interno, el cual está formado por ciclación de tres aminoácidos claves: Ser65, Tyr66 y Gly67 (Ilustración 1, ref. 1). 

La GFP original de la A. victoria posee dos picos de excitación: uno menor, a 475 nm, y uno mayor, a 395nm. Su pico de emisión está a 509 nm, en la zona verde del espectro. La excitación máxima de la versión salvaje (wtGFP) es a 395 nm. Sin embargo la intensa luz ultravioleta necesitada para la iluminación fluorescente, genera daños celulares y por tanto, no es un buen método para la monitorización de células vivas. De forma que comenzaron a desarrollarse por ingeniería genética métodos de mejora. Así se obtuvo  la variante S65T-GFP que tenía mucho más brillo que la wtGFP. También se adaptaron los codones para optimizar la expresión en células eucariotas de mamíferos superiores, se optimizaron las temperaturas de maduración de wtGFP, el plegamiento y se intentaron, con mayor o menor acierto, corregir los fenómenos de blanqueo (perdida de luminisicencia). Así surgieron un considerable número de variantes comerciales, obteniéndose además FPs mutantes de azul (BFP), cian (CFP) y amarillo (YFP). También se obtuvo la GFP súper-plegada que conseguía un gran plegamiento, a pesar de estar fusionada con polipéptidos con un deficiente plegamiento.

Para obtener mejores visualizaciones utilizando la monitorización de células con dos colores, comenzaron a desarrollarse las FPs rojas (RFP); éstas permitían el aumento del rango de excitación de forma que ofrecía la posibilidad de una mejor separación, entre los picos de emisión, usando los canales de separación (basados en filtro),  en combinación con otras FPs, y además, las células son menos sensibles a excitaciones con longitudes de onda grandes. Así finalmente se desarrollaron con las RFPs, métodos de FRET (fluorescence resonance energy transfer) en combinación con GFP o donadores de YFP.

En el Anthozoa Discosoma striata se descubrió la DsRed que fue la primera RFPs utilizada en estudios de monitorización celular. Aunque ésta presentaba grandes limitaciones, como la formación de un intermediario verde durante la maduración proteica, un brillo pobre, una obligada tetramerización (que no permitía su utilidad en experimentos de localización y su fusión con otras proteínas). Como con las GFPs, comenzaron a aparecer modificaciones. Así en el 2002 apareció la RFP1, un derivado de la tetramérica DsRed obtenida después de múltiples paso de evolución molecular, y que se convirtió en la primera RFP monomérica (mRFP); está incrementó espectacularmente sus propiedades de maduración. En 2004, la mRFP1 fue sometida a evolución molecular directa en combinación con selección de fluorescencia que permitió la obtención nuevas proteínas fluorescentes naranja y otras RFPs. En 2006, Fischer et al. desarrollaron la mRFPruby que disponía de cuatro cambios aminoacídicos adicionales y que permitía su uso en  líneas celulares de mamíferos, y en Drosophila.

Las aplicaciones en monitorización celular de las FPs son muy numerosas y esenciales en el desarrollo de la biología molecular. Han sido una herramienta útil para dar información de estructura y la dinámica de proteínas de fusión, que han permitido: conocer la estructura de la proteína nativa, relacionar su actividad y su función; detectar cambios de estructura, que pueden llevar a alterar su función; detectar cambios de estructura al interaccionar con otras macromoléculas o con ligandos, experimentos de colocalización proteicas…

Algunos ejemplos del uso de FPs los encontramos con el uso de mRFPmars en Dictyostelium, en combinación con GFPs, que permiten el estudio del citoesqueleto de actina y su dinámica (Ilustración 2).

También se han aplicado a la monitorización de redes neuronales y a la visualización de organismos completos que expresaban GFP, CFP e YFP mediante la transferencia de células madre embrionarias a la línea germinal.

La elección de unas FPs sobre otras requiere en general la consideración de si el experimento queremos realizarlo con una sola FP o con varias. Otro prerrequisito importante es la elección de la FP testigo de acuerdo al nivel adecuado de expresión. En general, para aplicaciones de monitorización in vivo las redFPs son más recomendables, dada su penetración más profunda, la reducción de auto-fluorescencia y la reducción importante en el daño celular.

Ref. general: Recent advances using green and fluorescent protein variants. By Annette Müller-Tauberger and Kurt I. Anderson. Appl. Microbil Biotechnol (2007) 77:1-12 DOI 10.1007/S00253-007-1131-5 (mini-review).

-Ref. 1: Ormö M, Cubitt AB, Kallio K, Gross LA, Tsien RY, Remington SJ. Science. 1996 Sep 6;273(5280):1392-5. Visualización en PDB (Protein Data Bank).